于是之早年求学于北京师范大学实验小学，随后进入北京师范大学附属中学完成初中学业。在其青年时期，十四岁的于是之便已展现出对戏剧艺术的浓厚兴趣。1942年，他积极参与了由北平青年群体组织的各类业余戏剧活动，由此开启了自身的艺术探索之路。两年后的1944年，于是之加入了辅仁大学同学发起成立的沙龙剧团，并在其中参演了个人首部话剧《牛大王》，这标志着他舞台实践的开始。1945年秋天，于是之成功考入北京大学西语系，主修法文专业，但入学后不久便因故辍学；此后，他正式投身于职业话剧团体，陆续参与了《蜕变》、《以身作则》等多部话剧的演出工作。1947年，于是之进入北平艺术馆工作，在此期间又参加了《上海屋檐下》、《大团圆》等剧目的演出，进一步积累了丰富的舞台经验。 1949年2月，于是之加入华北人民文工团，该团后来发展为北京人民艺术剧院。1951年，他在话剧《龙须沟》中成功塑造了鼓书艺人程疯子这一经典角色；同年，又在歌剧《长征》中饰演毛泽东，由此成为新中国成立后最早在舞台上扮演领袖毛泽东的演员之一，这在其艺术生涯中具有特殊意义。1952年，于是之光荣加入中国共产党；同年，他与于蓝、牛犇等演员联袂主演了剧情电影《龙须沟》。1958年，在话剧《茶馆》中，于是之精湛地诠释了那位年轻精明、处世圆滑的茶馆掌柜王利发，这一角色成为其表演艺术上的重要里程碑。1959年，他与谢芳等合作出演剧情电影《青春之歌》，在片中饰演地主家庭出身的大少爷余永泽。1960年，于是之与周正合作主演了战争题材电影《以革命的名义》。 1961年，于是之与戏剧家曹禺、梅阡携手，共同创作了历史剧《胆剑篇》；同年，他还与英若诚、童超等人合作，参与了话剧《像他那样生活》的改编工作。1978年，于是之与张瑞芳等著名演员共同主演了剧情电影《大河奔流》。1980年，他与郑榕、张平联合出演了剧情电影《丹心谱》。1982年，于是之主演了根据老舍先生同名话剧改编的剧情电影《茶馆》；同年，他还独立创作了话剧剧本《绝对信号》。1983年，于是之继续笔耕不辍，创作了话剧剧本《小井胡同》；同年，他与李秀明、李志舆联合出演了革命历史电影《秋瑾》，在片中饰演组织领导暴动的革命者竺绍康，凭借这一角色的出色演绎，他荣获第4届中国电影金鸡奖最佳男配角奖。 1984年，于是之被任命为北京人民艺术剧院第一副院长并主持日常院务工作。1985年，他当选为中国戏剧家协会副主席。1986年，于是之创作了话剧剧本《狗儿爷涅槃》。1987年，他撰写了表演理论专著《于是之论表演》，系统总结了自己的艺术心得。1988年，他又完成了话剧剧本《天下第一楼》的创作；同年，于是之当选为北京市戏剧家协会主席。1989年，于是之荣获中国话剧金狮奖“演员荣誉奖”，以表彰其卓越的舞台贡献。1991年，他开始享受国务院颁发的政府特殊津贴。1992年，于是之出演了由丁荫楠执导的人物传记电影《周恩来》。1995年，他出版了文学作品《论北京人艺演剧学派》，该书深入探讨并揭示了北京人艺演剧学派形成与发展的内在原因和历史脉络。1996年，于是之参演了个人艺术生涯中的最后一部话剧《冰糖葫芦》。1999年，由其创作的又一部文学作品《情泉》正式出版面世。 2005年，值中国电影诞生100周年之际，于是之被评选为“中国电影百位优秀演员”。2006年，他获得了表演艺术成就奖。2007年，于是之被授予“国家有突出贡献话剧艺术家”这一崇高荣誉称号。2009年，于是之再获殊荣，荣获首届中国戏剧奖·终身成就奖，为其辉煌的艺术人生增添了浓墨重彩的一笔。
在“演员于是之追思会”的现场，人们缅怀这位杰出艺术家的生平与贡献。于是之出生于艺术世家，他的舅舅是中国话剧与电影史上的重要人物石挥，而他的妻子是长期陪伴与支持其事业的李曼宜女士。2013年1月20日下午17时19分，于是之因疾病医治无效，于北京协和医院安详离世，享年八十六岁。他的逝世令戏剧界与社会各界深感痛惜。随后在1月24日，其葬礼以极为低调简朴的方式举行，灵车特意绕行他艺术生涯中具有象征意义的首都剧场一周，以此作为对他舞台生涯的深情告别。次日，即1月25日，北京人民艺术剧院为其举办了庄重而深情的追思会，众多亲友、同行与观众齐聚一堂，共同追忆于是之先生在舞台与生活中留下的宝贵艺术遗产与人格魅力。
于是之先生的表演艺术呈现出一种浑然天成、内敛含蓄且充满诗意的独特风貌。他本人尤为青睐那些思想深邃、形象生动并洋溢着浓厚生活气息的文艺作品。在艺术追求上，他始终崇尚真实、质朴与含蓄的表达方式，对于任何形式的虚假矫饰与刻意造作都抱持着鲜明的排斥态度。这种个人化的艺术品味与审美取向，无疑是塑造其独特表演风格的关键要素之一。在他看来，演员必须真诚地忠于生活，表演创作应当牢牢扎根于现实生活的土壤之中，这一理念构成了他艺术思想的核心基石。因此，于是之所塑造的每一个舞台形象，往往都承载着深刻的思想情感，内在底蕴丰厚，性格层次饱满，色彩鲜明突出；其成功的关键，在于他在整个艺术创造过程中始终坚持尊重生活原貌，严格恪守从生活实际出发这一根本创作原则。每当着手塑造人物时，于是之总会充分调动自己全部的生活阅历、社会认知以及长期积累的形象素材，让创造的热情从思想和情感的最深处自然迸发。正是这种方法，使得他所饰演的角色并非仅仅是对文学形象的简单舞台移植，而是能够通过演员卓越的二度创作，进一步深化和丰富原有文学形象的思想内涵与性格特质。得益于他对生活与人物鞭辟入里的深刻理解，他的表演常常焕发出一种思想丰厚、意境深远、令人回味无穷的艺术感染力。
二零一七年，正值著名表演艺术家于是之先生逝世四周年之际，作家出版社特别策划并出版了两部与其相关的文学作品，分别为《于是之家书》与《于是之漫笔》。其中，《于是之家书》一书精心收录了于是之在二十世纪五十年代至八十年代期间写给妻子李曼宜的大量私人信件。这部珍贵的“家书”集由李曼宜女士亲自参与编选工作，是于是之先生生前所写家书首次以较为完整和系统的方式结集面世。通过这些真挚而细腻的文字，读者得以窥见于是之先生在日常生活中的所思所感，同时也生动展现了以他为代表的老一辈知识分子在为人处世、治学敬业方面所秉持的崇高风范与精神面貌。与此同时出版的《于是之漫笔》则是于是之先生的散文与随笔精选集。这部“漫笔”选集由戏剧评论家童道明先生负责编选，书中汇集了于是之在不同时期撰写的散文、杂感和艺术随笔，从另一个侧面呈现了他在舞台之外深厚的文学修养与丰富的心灵世界。