马少骅于1955年9月23日出生在贵州省贵阳市的一个京剧世家，自幼便浸润在浓厚的戏曲氛围中，对京剧的唱腔、念白、身段以及武打等各项基本功都耳濡目染，打下了深厚的艺术基础。1963年，在完成小学三年级的学业后，他便进入贵州省艺术学校专设的京剧班，开始系统性地学习老生行当。1969年，他加入贵州军区文工团，正式成为一名舞台演员，在实践中进一步磨练自己的表演技艺。1975年，马少骅转入贵州省话剧团，继续从事演员工作，拓宽了自己的表演领域。1978年，他凭借扎实的功底和艺术潜力，成功考入上海戏剧学院表演系，在校期间专注于喜剧表演的学习与研究。1986年，他加入武汉话剧院，并在其剧目《黄兴》中饰演了重要角色黄兴，由此开启了他话剧舞台上的又一重要篇章。
一九九六年，马少骅在由濮存昕领衔主演的反腐刑侦题材电视剧《英雄无悔》中出演了刘贵田一角，由此正式开启了他的影视剧表演生涯。次年，他参演了电影《第九营》，这部影片成为他个人电影作品序列中的首部亮相之作。一九九八年，他加入了由唐敬睿执导的司法主题电视剧《大法官》的拍摄，在剧中生动塑造了王玉和这一人物，该剧后来于二零零一年在中央电视台一套节目首次与全国观众见面；同一年，他还出演了由丁荫楠导演执掌的“商海横流”三部曲中的开篇之作《商旗》。一九九九年，他与演员巫刚共同主演了悬疑警匪剧《铁血警魂》，在剧中饰演了果敢坚毅的刑警队长连克勤；也是在这一年，他参演了由巴特尔执导，程煜、李幼斌等主演的警匪题材电视剧《我是警察》，进一步丰富了其表演履历。 进入新世纪，二零零零年，马少骅担纲主演了历史革命剧《平民大总统》，在剧中首次饰演了中国民主革命的伟大先驱孙中山先生，该剧的叙事核心聚焦于孙中山先生在一九一二年一月一日至四月初于南京就任中华民国临时大总统那九十一天的风云岁月。二零零一年，他主演了历史题材电影《风雨十二年》，这是他首次在大银幕上塑造孙中山的形象，影片以孙中山与宋庆龄自一九一三年相识至一九二五年永别的深厚情感历程为主线，并主要通过宋庆龄的视角来回望与刻画二人波澜壮阔的一生。二零零二年，他参演了由张黎执导的宏篇近代史剧《走向共和》，在剧中再度诠释了孙中山这一历史人物，该剧于二零零三年四月在中央电视台一套播出。 二零零三年，马少骅主演了由强小路执导的二十集人物传记电视剧《张大千敦煌传奇》，在剧中饰演了中国国画大师张大千，该剧着重讲述了张大千在敦煌潜心临摹与研究壁画期间的艺术生涯与人生故事；此后不久，他在胡玫执导，陈宝国等众多实力派演员主演的历史正剧《汉武大帝》中，饰演了窦太后的侄子、性格复杂的权臣窦婴，该剧于二零零五年一月在中央电视台一套黄金时段隆重播出。二零零四年，他主演了一部八集的主旋律作品《当家人》，该剧是以党的十六大代表、十届全国人大代表、全国优秀共产党员李连成的真实事迹为生活原型进行创作的，马少骅在剧中成功塑造了村党支部书记李天明这一形象，生动展现了他一心一意为群众谋福祉，带领全村百姓艰苦奋斗、创业致富的感人历程。
二零零五年，演员马少骅与陶泽如联袂出演了由导演管虎执导的一部风格平实、贴近生活的纪实题材电视剧《生存之民工》。他在剧中生动塑造了谢老大这一复杂角色，这是一个来自河南的农民工形象，外表色厉内荏，为人圆滑自私，堪称江湖老手。这个人物既有着令人同情之处，又因其行为而显得可厌，其性格中善恶交织，善里藏恶，恶中亦存善念，展现出了底层人物在生存压力下的多面性。同年，马少骅还主演了一部聚焦唐太宗贞观盛世的历史正剧《贞观之治》，他饰演了唐朝初年的重要政治家长孙无忌。此角色在太宗与高宗两朝均官至宰相，深受唐太宗李世民的倚重和信任，是稳定朝局的关键人物。也是在这一年，他在由何炅领衔主演的古装历史题材剧集《正德演义》中，客串出演了手艺人工匠“糖人孙”一角。此后，他参与了著名导演康洪雷执导的一部犯罪题材剧情电影《一针见血》。紧接着，马少骅担纲主演了由陈胜利导演执导的抗日背景谍战剧《喋血1941》，该剧以日本侵华战争为历史背景，围绕一批黄金的归属展开激烈争夺，深刻描绘了在国家利益与民族存亡面前，各方势力错综复杂的斗争故事。 时间来到二零零六年，马少骅与演员刘金山搭档，共同主演了由谢晓梅执导的战争喜剧片《追杀横路靖六》。他在剧中扮演文家村的首富文善仁，这个人物家境殷实且心地善良，常常慷慨解囊、乐于助人。该剧的故事主线设定在一九四四年的冀中平原，主要讲述了八路军抗日武装与日本侵略者之间进行的英勇而机智的斗争历程。二零零七年，马少骅主演了一部革命战争题材电视剧《浴血坚持》，他挑战自我，饰演了老一辈无产阶级革命家、军事家陈毅元帅。为了更贴近角色，原本并不擅长骑马的马少骅在拍摄过程中数次从马背上摔下，但他依然坚持完成拍摄，其敬业精神可见一斑。同年，他还参演了一部公安刑侦题材的电视剧《暗流》，在剧中饰演了李局长这一职务角色。 二零零八年，马少骅在主旋律电视剧《红灯记》中，突破以往正面形象，首次尝试饰演反派，扮演了头号反面人物日本军官鸠山。这一角色转换展现了他作为演员的可塑性。同年，他与赵峥共同主演了一部讲述年代变迁的商业传奇剧《当家大掌柜》，在剧中他化身为忠义为本、处世精明、充满传统东方智慧的商号大掌柜肖子富。此外，他还在“梅花党”系列谍战剧《秘密列车》中出演了角色周明天。随后，他客串出演了由宁浩执导的喜剧电影《疯狂的赛车》，在片中饰演了由黄渤所扮演的主角耿浩的师父，为这部充满黑色幽默的影片增添了别样的人物关系与情感层次。
二零零九年，马少骅与李亚鹏联袂出演了抗战题材电视剧《关中枪声》，他在剧中塑造了梁守道这一角色，该人物在当时的陕西学界与政界均具有相当的影响力；同年，他再度与导演管虎合作，主演了革命历史剧《沂蒙》，凭借对剧中李忠厚一角的深刻诠释，他成功入围第二十八届中国电视剧飞天奖优秀男演员的评选；此后，他又在电视剧《好大一棵树》中，生动演绎了“100位新中国成立以来感动中国人物”之一的基层干部邓平寿。二零一零年，他主演了由管虎编剧并执导的现代都市生活剧《外乡人》，在剧中扮演了脾气暴躁、精于算计却又重情重义的出租车司机谢长发，这一角色为他赢得了第二十五届中国电视金鹰奖最佳男演员的提名。二零一一年，为纪念辛亥革命一百周年，他主演了史诗献礼剧《辛亥革命》，再次塑造了孙中山先生的形象，并因此获得第二十九届中国电视剧飞天奖优秀男演员提名；同年，他参演了由张黎、刘淼淼联合执导的战争历史剧《圣天门口》，该剧深刻展现了中国崛起历程中的坎坷与曲折；此外，他还出演了由韩三平执导、为庆祝中国共产党建党九十周年而制作的献礼影片《建党伟业》，在片中再度饰演了首任临时大总统孙中山先生。二零一三年，他与于震等演员共同主演了抗战剧《一个鬼子都不留》，饰演了山西杂耍班班主、庄继宗的结拜大哥、游击队队员李占魁，这个角色最终为拯救兄弟庄继宗而英勇牺牲。二零一四年，他在刘烨、陈宝国领衔主演的电视剧《北平无战事》中出演了林大潍一角；同年，他与张国立、陈宝国合作，共同主演了电视剧《原乡》，在剧中饰演了老兵杜守正；随后，他与萨日娜联袂主演了重大革命历史题材电视剧《历史转折中的邓小平》，成功饰演了邓小平同志，其表演得到了邓小平子女的认可，并凭借此剧荣获第十八届北京影视春燕奖最佳男主角奖以及第二十一届上海电视节白玉兰奖杰出贡献奖等多项荣誉；同年，他还与佟大为、关悦合作，主演了电视剧《我的儿子是奇葩》，在剧中扮演了楚三福这一角色。二零一五年，他主演了由丁黑执导的历史题材电视剧《冯子材》，在剧中饰演了清末将领、民族英雄冯子材；同年，他再次与萨日娜合作，参演了由于荣光执导、根据真人真事改编的纪实片《独龙之子高德荣》。二零一六年，他主演了由罗灿然执导的亲情励志剧《搭错车》，在剧中饰演了一位以收卖废品为生、将毕生心血都倾注于养女阿美的哑父，该剧播出后取得了全网收视率第一的优异表现；同年，他参演了由李雪执导的医疗行业都市剧《外科风云》，在剧中饰演仁合医院的院长傅博文。二零一七年，他主演了文艺电影《匠心》，塑造了性格孤傲冷僻的著名木雕工匠陆明松。二零一九年八月，他参演了革命历史剧《我们的西南联大》；同年九月，他主演了历史电视连续剧《民为天之丁宝桢》。
二零二零年五月一日，他登上了央视五一晚会的舞台，与刘佩琦、吴京安、侯勇、倪大红、刘劲等多位艺术家同台，共同深情演绎了一首诗歌朗诵作品《向胜利进军》；同年十一月二十七日，他参与了由中央广播电视总台文艺节目中心精心制作并推出的首档大型情感户外真人秀节目《走在回家的路上》的录制工作。进入二零二一年，一月八日，由他主演的电视剧《国家情怀》正式宣布完成全部拍摄工作；二月一日，他出演的另一部电视剧《觉醒年代》与观众见面，他在剧中成功塑造了著名教育家蔡元培先生的形象；五月十五日，他联合主演的一部聚焦重大历史革命题材的电视剧《中流击水》在中央电视台综合频道（CCTV1）与央视频平台同步播出；五月二十五日，他再度出演了一部重大革命历史题材剧集《光荣与梦想》；六月十八日，他参演的电影作品《守岛人》登陆全国院线；七月一日，他参演的另一部献礼电影《革命者》上映，同时，他参与演出的电视剧《锦心似玉》和《理想照耀中国》也与观众见面；十二月十七日，他为庆祝中国共产党成立百年而献礼的影片《一件棉袄》正式公映。 时间来到二零二二年，一月二十八日，他参演的一部聚焦社会现实的题材大剧《人世间》播出，他在剧中饰演了郝省长这一重要角色；八月一日，他主演的一部反映时代变迁的长篇现实重大题材电视剧《运河边的人们》播出，他生动诠释了剧中人物梁家轩；同年，他参演的另一部电视剧《八月桂花开》也陆续播出；十一月六日，他出席了第十四届中国电视金鹰奖颁奖晚会，并在当晚荣获第三十一届中国电视金鹰奖最佳男配角奖，这是对其表演艺术的高度认可；十一月十五日，他参演的又一部电视剧作品《山河锦绣》与观众见面。 二零二三年，他的艺术生涯继续拓展。三月十七日，他荣幸入选第三届新时代国际电视节斑彩螺奖颁奖典礼的专家评委名单；四月二十三日，他参演的一部青春励志革命历史剧《战火中的青春》上映，他在剧中饰演了哲学家冯友兰；十月十四日，他友情出演的作品《我的助理不简单》播出；十月二十六日，由他领衔主演的历史人物传记电视剧《丁宝桢》在中央电视台电视剧频道（CCTV-8）黄金强档播出，他成功塑造了清代名臣丁宝桢的形象；十二月十二日，他参演的电视剧《问苍茫》正式开播。 进入二零二四年，一月，他凭借在电视剧《丁宝桢》中的精湛表演，荣获“影视榜样·2023年度总评榜”最佳男主角奖；二月十日，他在第二届中国电视剧年度盛典上获得“年度实力男演员”荣誉；二月二十七日，他参演的电视剧《紫川·光明三杰》播出；六月十五日，他主演的一部公路喜剧题材电影《一片绿洲》上映，他在片中饰演了一位因失去爱子而陷入悲痛的父亲周建功，展现了其角色的复杂内心；十一月三十日，他参演的电视剧《蜀锦人家》播出。 展望已公开日程中的二零二五年，五月三十日，他将以特别出演的身份亮相电视剧《紫川之光明王》，饰演角色紫川参星；十月十日，他参演的另一部电视剧《三江潮》也将按计划播出。
马少骅的父亲马骏骅先生是一位承袭京剧麒派艺术的传人，曾担任贵州省京剧团的团长职务，在戏曲界享有广泛声誉；他的母亲王云秋女士同样是一位资深的京剧教师，多年来培养了许多优秀的学生，可谓桃李遍布天下。此外，马少骅的外公王无能先生更是当年上海滩著名的“滑稽三大家”之一，在曲艺领域具有重要的历史地位。由此可见，马少骅成长于一个艺术氛围极为浓厚的家庭环境，这无疑为他日后在表演艺术上的发展奠定了深厚的家学基础。
马少骅的妻子李兰荣女士在体操领域有着深厚的专业背景与卓越的贡献，她曾长期担任湖北体操队的资深教练。在她的悉心指导和培养下，涌现出了包括李小双、程菲在内的多位杰出体操运动员，这些运动员后来均在国内外重大赛事中取得了辉煌成就，成为了体操界闻名遐迩的世界冠军。李兰荣教练以其丰富的教学经验和严谨的训练方法，为中国体操事业的发展默默地奉献了自己的力量。
在电视剧《搭错车》中，马少骅所饰演的哑爸全程依靠手语进行交流，这种独特的表达方式初看或许令人感到些许陌生与诧异，然而随着观众逐渐深入剧情，便会发现那无声的手势往往比有声的语言更能传递出深沉的情感与丰富的内心世界。而在另一部作品《沂蒙》里，他化身农民李忠厚，如同从沂蒙山野间自然生长出的一株麦苗，质朴无华却扎根土地；到了《历史转折中的小平》中，他诠释的小平同志，则生动展现出在历史转折关头掌舵领航的伟人所具备的果敢与坚毅；在《走向共和》里，他又将立于时代浪潮前沿的孙中山先生塑造得正气凛然、令人敬仰。正是哑爸这一角色，尤其凸显了他与以往所塑造其他人物的鲜明区别。他既能演绎顶天立地、影响时代的大人物，也能刻画在生活底层默默耕耘的小角色；既能扮演口若悬河、挥斥方遒的演说家，也能成为沉默无言、终日劳碌的拾荒者。这种不断突破自我局限、持续提升艺术境界的追求，体现了他对梦想的纯粹执着、对事业的坚定定力以及对人生百态怀有的深切温情，而这正是一位优秀演员所应具备的可贵品质。马少骅自身耿直刚正的性情，也促使他始终抱有一份对年轻一代的关怀与责任。在他看来，成为一个真善美的人是好演员的根本标准，作为一位资深的老艺术家，他更注重以身作则、躬亲实践，努力为行业树立新的风气，在展现良好职业形象方面发挥积极的引领作用。