叶祖新自幼成长于淳朴的乡村环境之中，在临近大学毕业的人生阶段，他凭借自身特质引起了著名导演尤小刚的关注。尤小刚主动与他接触，不仅询问他是否对表演艺术抱有真挚的兴趣，还向他发出了加入其影视公司的诚挚邀请。面对这个可能改变人生轨迹的机遇，叶祖新内心怀揣着对广阔天地的向往，决定抱着前往北京开拓视野、历练一番的心态，正式踏上了充满挑战与可能的演艺道路，由此开启了他职业生涯的全新篇章。
叶祖新于2003年正式踏入演艺圈，其出道作品是青春爱情题材的电视剧《情断上海滩》，他在其中饰演了名为孙伟的角色，由此开启了个人演艺生涯。两年后，即2005年，他参与了古装电视剧《李小环与苗翠花》的拍摄，并在剧中扮演了经典人物方世玉，进一步积累了表演经验。2011年，随着穿越题材剧集《步步惊心》的热播，叶祖新凭借饰演十阿哥爱新觉罗·胤俄这一角色而广为人知，他以其率真自然的性格诠释和乖巧可爱的荧幕形象，赢得了大量观众的青睐与认可。正是通过这部剧中的出色表现，他在2013年风尚权力榜颁奖典礼上荣获了年度飞跃新人奖，标志着其事业的一个重要里程碑。紧接着的次年，电视剧《活佛济公3》于东方卫视播出，叶祖新在剧中化身为小和尚必清，展现了角色的灵动与纯真。同年，另一部电视剧《新白发魔女传》也与观众见面，他在其中扮演了武当派小师弟辛龙子，塑造了一位年轻而富有朝气的武林子弟形象。同年1月，由他主演的电视剧《怪侠欧阳德》登陆江苏卫视，叶祖新挑战了反派角色淳贝勒，其演技得到了进一步的拓展。2013年，古装剧《大唐女巡按》播出，他饰演了书生欧阳天明，展现了文雅而深情的另一面。到了2014年，电视剧《步步惊情》播出，叶祖新尝试了一个名为Jack的阴柔化角色，为了精准塑造这个妖娆妩媚的人物，他曾特意向当时的女友、即在《甄嬛传》中饰演华妃的演员蒋欣请教和学习，以求更好地把握角色特质。同年，在江苏卫视播出的古装剧《隋唐英雄4》中，他饰演了薛丁山一角，并与孙耀琦饰演的樊梨花共同演绎了一段曲折而动人的虐恋故事，给观众留下了深刻印象。2015年，叶祖新参与了浙江卫视推出的明星密室逃脱类真人秀节目《星星的密室》，凭借出色的解谜能力和团队协作精神，他最终赢得了首季的总冠军，展示了其在综艺领域的潜力。同年，抗日谍战情感大戏《铁在烧》于浙江卫视播出，他在剧中饰演了丁丑娃这一角色，深入刻画了在特殊历史背景下人物的情感与抉择。同年9月，电影《穷途》正式上映，该片讲述了一群前往土家族寻找“苗药秘方”的青年男女在旅途中发生的诸多趣味横生的故事，叶祖新在片中饰演了邹孝宇，为这部充满冒险与喜剧色彩的作品增添了亮色。
二零一六年，演员叶祖新参演了动作悬疑题材剧集《左眼诡事》，在剧中他扮演捉妖公司的经理尹明涯。他以细致入微的表演处理，将人物的内心层次展现得颇为到位，由此赢得了众多观众的认可与好评。同年，在另一部电视剧《蜀山战纪之剑侠传奇》中，他饰演了名为张馅饼的角色，据他透露，这个有趣的名字来源于角色设定中特别能吃的特点——一次可以吃掉十几个馅饼，因而得名。此外，叶祖新还亲自为该剧献声，演唱了片尾曲《我就是我》，展现了其在表演之外的音乐才能。九月，一部都市情感剧《爱情万万岁》正式播出，他在剧中出演金波一角，通过对人物性格与命运走向的深入揣摩和细腻刻画，他将金波这一形象塑造得鲜活而富有感染力，获得了观众与业内的肯定。进入二零一七年，都市时尚行业剧《一粒红尘》与观众见面，叶祖新在剧中饰演酒吧老板闵朗。他在访谈中提到，尽管自己最初不太理解角色所持有的某些情感观念，但正是这种复杂性为他提供了广阔的表演空间，使他能够深入探索人物的多面性。同年三月，电影《嫌疑人X的献身》登陆院线公映，叶祖新在片中饰演警察罗淼。这是他首次参与电影演出，对他而言，选择这样一个需要大量心理活动与逻辑推演的“烧脑”角色，既是一次专业上的挑战，也带来了表演上的全新乐趣。凭借对罗淼一角的成功诠释，叶祖新实现了个人戏路上的重要转变，从以往清新阳光的荧幕形象，逐渐过渡到更为成熟、内敛的表演风格，标志着其演艺事业的稳步成长与突破。
在2018年与观众见面的电视剧《橙红年代》中，叶祖新所扮演的贝小帅一角，是一位表面看似随性不羁、实则内心怀揣远大理想的热血青年，这一角色展现了他对人物多层次性格的精准把握。随后在2020年，情感题材剧集《还没爱够》正式播出，他在剧中饰演了汪聪，在谈及这个角色时叶祖新坦言，尽管角色境遇与个人选择有所不同，但他本人对于婚姻家庭始终抱有美好的憧憬与向往。同年，他还在电视剧《清平乐》中挑战了内侍张茂则这一历史人物，他回忆起初次阅读剧本时，其中大量的文言文台词曾让他感到理解困难，直至正式开机前他仍在反复背诵这些台词。为了能够更好地完成拍摄，他采用了手抄台词的方法，通过一边朗读一边抄写、抄写后再反复诵读的方式，逐渐沉浸到宋朝特有的历史氛围与语言环境之中。同样是在这一年，于央视节目《衣尚中国》里，他化身历史人物赵明诚，与张馨予饰演的李清照共同演绎了一段流传千古的文人爱情故事。2021年，聚焦清华大学硕士毕业生返乡创业、带领村民脱贫致富的电影《青春作伴好还乡》登陆院线，叶祖新在片中饰演了主人公管松江，生动塑造了一位新时代的奋进者形象。2023年，电视剧《战火中的青春》播出，他饰演的叶润名以其坚定的信念与牺牲精神深深打动了观众，被许多人评价为以自身行动乃至生命深刻诠释了西南联大“刚毅坚卓”校训的灵魂人物。进入2024年，他的作品持续与观众见面：4月27日，参演的电视剧《微暗之火》播出；6月17日，另一部参演剧集《金庸武侠世界》也与观众见面。9月23日，他友情出演的网络剧《镇魂街之热血再燃》上线。10月9日，其参演的电视剧《七夜雪》播出；11月1日，他参与了中央广播电视总台的文化综艺节目《宗师列传·大唐诗人传》，并在节目中精彩演绎了诗人杨炯；12月6日，一部主打双强对决、高智商博弈的古装爽剧《九重紫》播出，他在其中亦有出演。2025年伊始，其演艺活动依然活跃：1月1日，参演的电视剧《真心英雄》播出；3月3日，出演的现代剧情剧《北上》与观众见面。4月30日，他主演的网络剧《灭罪》正式上线。7月26日，出演的古装武侠剧《华山论剑》播出；9月16日，其参与的抗战题材剧集《阵地》播出；12月12日，参演的电视剧《长安二十四计》也与观众如期相约。来到2026年，1月31日，另一部有其参演的电视剧《年少有为》也顺利播映。
2013年11月11日，演员叶祖新与蒋欣通过个人微博平台进行公开互动，以此正式向外界公布了双方的恋爱关系。这段恋情在当时受到了许多粉丝与公众的关注。然而，这段关系并未能长久持续，在2015年3月12日，两人再度通过公开渠道共同宣布，他们已决定结束恋人关系，并强调此次分手是经过友好协商后的和平决定，彼此今后将各自专注于事业发展。
自2014年起，演员叶祖新便持续投身于多项公益慈善活动。当年8月，他积极响应歌手韩红的号召，参与了“韩红爱心-百人援青”大型公益医疗救助行动，深入青海地区为当地民众提供医疗援助。次年8月，叶祖新再度跟随“韩红爱心百人援贵”公益团队，前往贵州省罗甸县边阳镇担任志愿者，亲身投入到基层医疗援助服务之中。2021年7月，当河南省遭遇特大暴雨灾害时，叶祖新又通过韩红爱心慈善基金会向灾区慷慨捐款，贡献自己的一份力量。根据相关统计，截至2025年1月7日20时，韩红爱心慈善基金会累计接收到来自叶祖新等二十八位文艺工作者的爱心捐赠，捐赠款项总额达到五百七十四万元人民币。目前，这些筹集到的善款计划重点用于为受灾群众采购御寒保暖的各类物资，以缓解他们在寒冷季节的生活困境，同时也将持续助力受灾区域的灾后恢复与重建工作，帮助当地民众早日恢复正常生活。
在电视剧《隋唐英雄》中，叶祖新所塑造的薛丁山这一角色，展现出与过往荧幕形象截然不同的独特魅力。他策马驰骋时的飒爽英姿尤为引人注目，而那一双饱含复杂情感的眼眸，更是在细微处传递出人物内心的波澜，令观众为之动容。此外，叶祖新在另一部作品《铁在烧》里，则凭借其精湛而细腻的表演功力，将丁丑娃这一人物刻画得入木三分。他精准地把握了角色的情感脉络，使得丁丑娃的爱与恨都显得格外真实而鲜活，人物形象因此丰满立体，仿佛跃然于荧屏之上。